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BrdU体内标记腺样囊性癌肺转移灶的实验观察

时间:2009-03-17 18:32:22  作者:   来源:口腔医学网   查看:  485

关键字:BrdU体内标记腺样囊性癌肺转移灶的实�

　　摘　要：目的　动态观察非放射性标记物BrdU在动物体内标记情况，为BrdU取代3H-TdR提供依据。方法　6只裸鼠经尾静脉分别注入Acc-M细胞1×106/0.2ml,4周后腹腔注射BrdU 200μg/g体重，注射0.5h～20h期间分别取材固定，免疫组化ABC法染色，统计标记指数。结果　所有裸鼠形成肺转移癌阳性细胞核标记指数(LI)约20%～40%。单次注射BrdU后，LI不随注射时间延长而增加。正常组织中，肝窦和肠绒膜上皮有标记阳性细胞，肾、胰、脾等器官未见。结论　BrdU体内标记法可替代3H-TdR应用于细胞增殖研究，避免放射性污染，但在人体内标记，尚需进一步探索。

　　氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)标记用于细胞增殖及分子遗传研究等早已成为常规，但有放射性污染、检测复杂、费时等缺点。因此，许多学者致力于研究非放射性标记物的开发和应用。溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争掺入S期细胞DNA，其掺入机制、掺入敏感性及可靠性均与3H-TdR相似，是80年代中期以来最受重视的非放射性标记物之一。由于BrdU属小分子半抗原，且价格昂贵，国内研究明显滞后，近年才见个别报道。本文在BrdU抗原制备和抗体制备等前期工作的基础上，用BrdU对本室克隆筛选的高转移性腺样囊性癌细胞(Acc-M)［1］产生的裸鼠肺转移癌模型进行动物体内标记，初步观察BrdU在体内标记的效果，为深入研究并最终取代3H-TdR奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂和动物

　　BrdU多克隆抗体(PcAb)，工作效价1∶6.4×105，上海第九人民医院口外实验室制备；羊抗兔IgG，上海市医学检验重点实验室；正常羊血清，Vector公司；ABC Kit,Vector公司；BrdU,MW307.12D，Sigma公司；Acc-M，上海第九人民医院口外实验室克隆；BALB/c裸鼠，中科院上海实验动物中心。

　　1.2　肿瘤模型的制备

　　取6周雌性BALB/c裸鼠6只，无菌饲养，经鼠尾静脉分别注射Acc-M细胞1×106/0.2ml，诱发肺转移癌。4周后，于每只鼠腹腔注射PBS溶解的BrdU 200μg/g体重，分别于注入BrdU 后0.5、1、2、4、16和20h各处死1只，解剖肺、肠、肝、胰、脾和肾等器官，70%酒精固定＞24h，常规石蜡包埋、切片。

　　1.3　BrdU标记免疫组化染色

　　5μm连续切片于50°C烤箱热烘30min，脱蜡至水；0.3%过氧化氢甲醇，室温30min;0.05mol/L pH7.6 Tris-HCl缓冲液洗涤5min×3;2mol/L HCl 37°C,30min;1mol/L NaOH室温2min;0.05%胰蛋白酶，室温30min;10%羊血清，室温30min;BrdU PcAb(1∶200),4°C过夜；阳性对照为BrdU抗体(1∶50),Vector公司；阴性对照为Tris-HCl缓冲液；自然复温20min后，羊抗兔IgG(1∶200)30min;ABC(1∶100)室温1h;DAB镜下显色，苏木素复染，封片。主要步骤之间均以Tris-HCl缓冲液洗涤。

　　1.4　观察方法

　　每张切片随机观察1000个细胞，计数阳性细胞核标记指数(LI)。

 　　2　结果

　　接种Acc-M细胞4周后，6只裸鼠全部形成肺转移癌。鼠肺体积均有增大，表面簇状密布灰白色小结节，质韧实。光镜下BrdU阳性标记为胞核黄褐色，肺转移癌组织的LI约20%～30%。转移癌的癌巢中阳性细胞LI高达40%左右，有丝分裂像多见，见图1。

 　　注射BrdU后不同时间的癌组织LI无明显差别，即使注入20h时，其肺转移癌的LI也未见增多。其它组织如肝脏的血窦周围和肠绒毛上皮细胞也可见阳性标记细胞，见图2、图3。而在肾、胰、脾等脏器的各不同时间的取材标本，均未见到阳性细胞。

　　3　讨论

　　Acc-M细胞形成裸鼠肺转移癌的结果确切稳定，而且BrdU体内掺入的LI高达40%，说明Acc-M细胞增殖非常活跃，所形成肿瘤的生长潜力大，恶性程度度。BrdU选择标记S期细胞，并随标记细胞增殖传代，使子代细胞显色。本组标本BrdU标记后于不同时间取材固定，但BrdU掺入标记结果无明显变化，并非随BrdU注入动物体内的时间延长，而LI增多。BrdU的掺入半衰期不足3h［2］，而Acc-M细胞的增殖周期为38h［1］。本文采用一次性脉冲标记方法，未连续追加，因此，即使20h时观察的LI也未见有明显增加，可能因Acc-M细胞倍增时间长，BrdU半衰期短两方面因素所致。有人用可生物降解的缓释胶囊装载BrdU注入体内或在体内组织中埋植BrdU渗透性微型泵等方法［2～4］，以控制BrdU释放血流中的剂量和节奏，从而使BrdU标记目标可动态观察。这种方法对增殖周期较长，增殖缓慢的组织细胞能收到较好效果，如神经组织的生长等。

　　BrdU选择性掺入S期细胞新合成单链DNA的特点，使其可广泛用于肿瘤增殖动力学、药物代谢动力学、分子细胞生物学、遗传学、免疫学及核医学等领域。Kitazaws等用BrdU标记对白血病细胞HL-60和K562的基因表达进行研究，将标记DNA与RNA原位杂交，发现80%用于合成DNA的胸腺嘧啶被BrdU替代［5］。BrdU替代3H-TdR应用不仅避免了放射性污染，检测方便迅速，便于推广，而且比3H-TdR标记有更大的应用价值。我们曾在以往的研究中，用BrdU标记SD大鼠涎腺组织，进行动态观察，从细胞形态上直接识别腺泡细胞、润管细胞和纹管细胞的变化，从而证明腺泡细胞和纹管细胞也有复制能力［6］，而3H-TdR标记则难以通过形态的识别达到此目的。

　　目前，国外已初步将BrdU用于人体内标记，但由于BrdU有致突变可能，用于人体时尚需通过医学伦理委员会批准。Tinnenans对44例肺癌患者以50mg/m2体表面积的用量体内标记BrdU，发现BrdU掺入与PCNA、Ki67抗原表达指标有很好的相关性。他认为用BrdU标记反映细胞增殖比核增殖抗原的表达更客观准确［7］。BrdU能否最终完全取代3H-TdR的应用，以及BrdU的理化特性和实用价值将随着深入探索，进一步被认识。