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金钢石碳—钛复合体的生物相容性评价—NK细胞活性和IL-2产生能力测定

时间:2010-03-11 08:34:55  作者:   来源:   查看:  19

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【摘要】目的：检测类金钢石碳—钛复合体（diamond－like－carbon titanium,DLC－Ti）对机体NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)活性和IL－2(白细胞介素Ⅱ，intereukins Ⅱ)产生能力的影响。方法：将DLC－Ti、纯钛、医用不锈钢、纯铜4种材料植入小鼠体内，分别于1、2、4和6周后检测NK细胞活性和IL－2产生能力。结果：DLC－Ti在术后第4周使NK细胞活性和IL－2产生能力降低明显（P<0.01），至第6周时已基本恢复正常。而纯钛对两项指标的影响都比DLC－Ti明显，NK细胞活性在实验后期仍受到明显抑制。结论：DLC－Ti具有比纯钛更好的生物相容性。
　　近几年有不少国外研究者对类金钢石碳(DLC)这种近代研制出的优异的涂层材料寄以很大希望而多方进行研究[1,2]。我们已经对DLC－Ti的生物相容性进行了细胞毒性评价[3]，骨内种植的酶组化研究和机体T淋巴细胞亚群的评价，均证实了DLC－Ti比纯钛有更好的生物相容性。种植材料对免疫系统的影响同种植成功率以及术后并发症的发生有关[4]。本实验将DLC－Ti、纯钛、医用不锈钢和纯铜植于小鼠体内，检测材料对机体NK细胞活性和IL－2产生能力的影响，进一步探讨DLC－Ti对免疫系统的影响。

表1　术后NK细胞活性(％)变化(±S)
 

时间/（周） A（组） B（组） C（组） D（组） E（组）
1 10.79±2.94 8.54±1.76△ 7.73±2.13△△ 4.87±0.87△△＊＊ 4±56＋1.48△△＊＊
2 213.04±1.63 11.43±3.47 8.40±2.08△△＊ 6.29±2.26△△＊＊ 8.73±2.59△△
4 431.63±4.76 25.40±4.48△△ 23.14±3.14△△ 22.073±10△△ 1.15±6.97△△＊＊
6 612.21±1.72 11.41±2.45 9.11±2.31△△＊ 5.66±1.40△△＊＊ 4.69±2.03△△＊＊

注：同A相比△P<0.05，△△P<0.01 同 B相 比 ＊P<0.05，＊＊P<0.01 n=7,表2同此
1材料和方法

1.1植入材料
　　选用4种材料：DLC－Ti、纯钛、8－18镍铬不锈钢合金和纯铜（作阳性对照）。上述材料制备成5×2×1mm3长方体，于实验前酒精梯度脱酯，高压灭菌后备用。
1.2主要试剂与细胞株
1.2.1YAC-1细胞株（小鼠T淋巴瘤细胞株），CTLL-2细胞株（小鼠细胞毒T细胞株）。均由中国医科大学微生物教研室传代培养。
1.2.2ConA（Vnt刀豆蛋白－A,Sigrna）使用浓度为10μg/ml。
1.3动物实验方法
　　健康雄性BALB/C鼠175只，体重18±2克，随机分作5组，每组35只，A组（对照组）；B组（DLC－Ti组）；C组（纯钛组）；D组（医用不锈钢组）；E组（纯铜组）。在每个实验组的小鼠左侧大腿内侧种植一种材料，对照组只进行切开缝合。分别于术后1、2、4、6周取脾检测NK细胞活性和IL－2产生能力。
1.4NK细胞活性测定方法[5,6]
1.4.1效应细胞制备：分离脾细胞悬液，调整细胞数为5×106/ml。
1.4.2靶细胞制备：取传代培养数YAC－1细胞，调整细胞数为1×105/ml。
1.4.3NK细胞活性测定：取96孔细胞培养板，每孔加效应细胞0.1ml，靶细胞0.1ml，最大释放细胞加10％NP－40于靶细胞中，自然释放组加0.5％BSA－RPMI1640液0.1ml代替效应细胞，置5％CO2、37℃培养箱中培养4小时，每孔加RPMI－1640液0.5ml，离心，弃上清0.1ml，加LDH液底物混合液0.1ml，作用1小时后测OD值（λ=490nm），计算NK细胞活性。

1.5IL－2产生能力的测定[5,7]
1.5.1IL－2诱生：制备脾细胞悬液，用含5g/mlConA的营养液调整细胞数为5×106/ml，置5％CO2培养箱中48小时，离心过滤，收集富合含IL－2的上清液，－20℃保存待测。
1.5.2检测细胞的制备：取传代培养24～48小时的CTLL－2细胞，调整细胞数为1×105/ml。
1.5.3IL－2活性单位测定：倍比稀释待测样品及标准品，每孔加CTLL－2细胞0.1ml，MTT液25μl，5％CO2培养箱培养4～6小时，每孔加10％NP—40100μl，4℃避光过夜，测OD值（λ=570nm），计算标本IL－2活性单位。

2实验结果

2.1NK细胞活性测定结果
　　同对照组相比，各实验组的NK细胞活性都有降低，DLC－Ti组在术后1、4周NK细胞活性受抑制明显，至第6周基本恢复正常，同对照组相比无统计学意义，而其它实验组的NK细胞活性都受到明显抑制，且同DLC－Ti相比差异也显著，见表1。
　　将对照组（A组）的数值作参考值，设为100％，其它各材料组的数值同参考值相比较得出相对变化百分率，绘制成各组NK细胞活性的相对变化趋势，见图1。
2.2IL－2产生能力的测定结果
　　各实验组的IL－2产生能力同对照组相比都有降低趋势。DLC－Ti组在第4周时IL－2产生能力受抑制非常明显，至第6周时同对照组相比，无明显差异，说明基本恢复正常。纯钛和医用不锈钢组的IL－2产生能力在前4周降低明显，第6周时降低同对照组相比无统计学意义，说明也基本恢复正常，而纯铜组的IL－2产生能力始终未能恢复，见表2、图2。

图2术后各组IL－2产生能力（％）变化趋势（±S）

图1术后各组NK细胞活性（％）变化趋势

表2　术后IL－2产生能力（u/ml)变化情况（±S）

时间/（周）	A（组）	B（组）	C（组）	D（组）	E（组）
2	214.79±1.69	12.86±2.88	8.81±2.63△△＊＊	7.10±2.25△△＊＊	5.42±1.44△△＊＊
4	430.37±8.53	17.08±4.42△△	16.31±7.35△△	6.88±3.30△△＊＊	3.94±1.66△△＊＊
6	623.17±8.53	22.81±4.17	18.46±4.52	16.35±7.06	8.07±2.81△△＊＊

3讨论 　　构成体内排斥反应的主要效应细胞，因而测定NK细胞活性和IL－2产生能力，可以反应出种植材料植入体内后对机体免疫系统的影响，是材料组织相容性评价的一个重要方法[5,8]。本实验观察到植入DLC－Ti后机体NK细胞活性和IL－2产生能力在第4周时降低最明显(P<0.01)，至第6周时基本恢复正常水平，其动态变化结果指出DLC－Ti对免疫系统只具有短时间的抑制作用。而纯钛组的NK细胞活性在整个实验期间都受到明显抑制(P<0.01)，IL－2活性在前4周受到明显抑制，至第6周时基本恢复正常水平，同DLC－Ti组相比，纯钛组的NK细胞活性在实验后期较DLC－Ti有降低趋势(P<0.05)，说明纯钛对免疫系统的影响较DLC－Ti的影响大，且在实验期间内对非特异性细胞免疫功能的抑制较特异性细胞免疫功能的抑制明显。其它两种材料对免疫系统的抑制更明显，尤以纯铜为甚。以上结果说明了DLC－Ti具有比纯钛更好的生物相容性和组织亲和性。 　　由于本研制的DLC－Ti在制作工艺上较国外研究者简单[2]，可以在近室温下操作完成，且具有优异的生物力学特性[9]，因而DLC－Ti所具有的NK细胞是机体非特异性细胞免疫的重要构成部分，有自然杀伤和ADCC效应，并能通过分泌IL－2增强抗原诱发的T细胞增殖应答，NK细胞活性是机体抵抗能力的一个标志。IL－2是机体重要的淋巴因子之一，是机体特异性细胞免疫的重要构成部分，在机体免疫认别、应答、调节中，尤其在免疫活性细胞活化、增殖、分化及免疫效应细胞的功能发挥方面，在细胞因子网络相互调节中起着不可忽视的作用。IL－2能活化T细胞、B细胞，促进它们增殖和分化，分别产生细胞因子和抗体，并增强NK细胞的活性，均为免疫应答的活性细胞，是较纯钛更好的生物相容性为口腔种植界提供了一种更理想的复合种植材料。