几丁质作为植骨材料生物相容性的实验研究

时间:2010-05-04 07:28:40  作者:  来源:  查看:  64 关键字:

〔摘要〕　目的: 观察几丁质作为植骨材料的生物相容性。方法:通过体外实验与体内实验相结合的方法研究。结果: 几丁质对人成骨细胞具有良好的相容性,不影响人成骨细胞的增殖及ALP活性,人成骨细胞可以在几丁质膜表面较好地贴附和伸展, 但增殖较慢。培养40 d时可以形成矿化结节。几丁质植入肌肉中，周围组织无明显炎症反应，未发现组织变性和坏死，并可完全降解。结论:几丁质具有较好的骨性生物相容性，但仍需提高其表面活性。
关键词　 几丁质；植骨材料；成骨细胞

　　医用材料的生物学评价已引起了人们的广泛重视，根据安全、有效的原则，理想的生物材料不仅要有临床所需的理化特性及有效性，同时还需要有良好的生物相容性。近年来,几丁质及其衍生物作为生物材料获得了广泛的重视〔1〕。本文重点研究了几丁质作为植骨材料的生物相容性。

1　材料与方法
1.1　材料
　　精制蚕蛹几丁质(中科院上海昆虫研究所)，MTT(Sigma)， ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，DMEM培养液（Gibco）。
1.2　方法
1.2.1　几丁质浸出液对培养人成骨细胞(OB)增殖的影响
　　①几丁质浸出液的制备
　　盘状几丁质，计算其表面积后按每平方厘米加入10 ml DMEM培养液，置于37 ℃ DMEM培养液中， 24 h后取上清，加入FBS使之成为含体积分数为10％FBS的浸出液并作为起始浓度，按倍比稀释作梯度测试。
　　②人胚成骨细胞(OB)的培养
　　按司徒镇强等〔2〕介绍的方法进行。
　　③几丁质浸出液对人OB增殖的影响
　　取第五代人OB，胰酶消化后调整细胞浓度至2×104/ml，加入96孔板，每孔100 μl。培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入倍比稀释的浸出液，共设6组，1/1(原始浸出液)、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，每组4孔,对照组仅加培养液。培养96 h后,进行MTT测定，结果进行统计学分析。
　　④几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
　　分组及浸出液加入同1.2.1.3, 细胞接种浓度为5×104/ml,每孔加入100 μl。培养96 h后，进行ALP测定，结果进行统计学分析。
　　⑤几丁质体内降解速度的实验研究
　　重20 mg块状几丁质，无菌条件下植入小鼠背部皮下和股部肌肉中。分别于术后2、4、6、8、10、12 周各处死4只小鼠，取出材料,干燥后称重。
　　⑥多孔几丁质组织相容性的实验研究
　　制备多孔几丁质,植入小鼠股部肌袋中，分别于术后2、4、6、8 周取材，进行材料周围软组织的肉眼观察及组织学检查。
　　⑦人OB在几丁质膜上生长及矿化的观察
　　在几丁质膜上接种人成骨细胞后，用矿化液进行培养,倒置显微镜观察。连续培养40 d，分别于3、20和40 d时取出标本,扫描电镜观察。

2　结　果
2.1　人OB的培养
　　人OB形状主要为三角形和四方形，5 d左右长满瓶底，此时细胞外观为铺路石状(图1)。用钙-钴法进行ALP染色，大部分细胞为阳性，胞浆染成棕黑色。

2.2　几丁质浸出液对人OB增殖的影响
　　MTT加入后4 h,各培养孔底部都有紫黑色结晶形成,基本均匀一致。测量吸光度值，经统计学分析，各组间均无显著差异(表1)。

表1　不同浓度的几丁质浸出液对人OB增殖及ALP活性的影响
 

	浸出液浓度
	对照组	1/1	1/2	1/4	1/8	1/16	1/ 32
增殖	0.63±0.02	0.61±0.06	0.59±0.04	0.64±0.05	0.66±0.08	0.58±0.06	0.62±0.03
ALP活性	0.43±0.03	0.39±0.05	0.41±0.03	0.40±0.05	0.41±0.07	0.43±0.02	0.45±0.06

2.3　几丁质浸出液对人OB ALP活性的影响
　　测量吸光度值，经统计学分析各组间均无显著差异(表1)。
2.4　几丁质的降解速度
　　植入皮下2周时，几丁质与周围组织广泛粘连,体积膨胀；植入4周后，体积明显缩为原来大小的1/2左右；植入6 周后完全吸收。植入肌肉间隙中约10周完全吸收(图2)。