口腔鳞癌中血管内皮生长因子表达和微血管密度与预后关系的研究

时间:2010-08-30 09:50:22  作者:  来源:  查看:  114 关键字:

 [摘要]   目的   研究微血管密度(microvessel density,MVD)和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在口腔鳞癌中的表达，探讨其与预后关系。 方法  采用SABC免疫组织化学染色方法检测56例口腔鳞癌中MVD和VEGF的表达，采用SPSS软件行统计分析。结果  51.8%口腔鳞癌组织呈VEGF阳性表达。VEGF表达阳性的口腔鳞癌组织MVD显著高于VEGF表达阴性者（P<0.05）。

   VEGF表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关，而与肿瘤的临床分期无关。VEGF阴性表达的病人术后5年生存率较阳性表达者高。MVD记数与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及临床分期密切相关。口腔鳞癌患者MVD高记数组较低记数组预后差。 结论  口腔鳞癌组织VEGF表达与微血管密度有明显的相关性，是口腔鳞癌主要的新生血管诱导因子之一，VEGF、MVD可做为口腔鳞癌预后的一个有效指标。  
 [关键词]  口腔鳞癌    血管内皮生长因子   肿瘤微血管密度     预后

Vascular Endothelial Growth Factor Expression and  Micro-vessel  density in Oral Squamous
Cell Carcinoma  and  Their  Relation to Prognosis   LI  Xiao-guang ，LI Ning-yi， HOU Gang，et
al. Department  of  Stomatology，Taian  City  Central  Hospital，Shan dong  Province  2710000, 
China

[Abstract]  Objective  To evaluate the clinical significance of microvessel density(MVD) and vascular endothelial growth factor(VEGF) expression in oral squamous cellcarcinomas. Methods unohistochemical staining(SABC) was used to quantify MVD and VEGF expression in specimens  from 56 patients with oral squamous cell carcinomas.SPSS
statistical software was used. Results: VEGF expression was observed in 29 of the patients(51.8%).The microvessel count was significantly higher (p<0.05) in the OSCC with
VEGF expression than in the OSCC without it. In the  clinicopathologic factors, lymph node
metastasis(p<0.05) and differentiated degree (p<0.05) were  significantly correlated with VEGF expression,but there was no significantly correlation between the clinicopathologic
stage and VEGF positive expression. The 5-year survival rate after curative surgery was
better in the patients without VEGF expression (p<0.05).  There were significantly
correlation between the lymph node metastasis(p<0.05)、differentiated degree (p<0.05)、
clinicopathologic stage and highter MVD count. The 5-year survival rate after curative
surgery was better in the patients with  lower MVD count (p<0.05). Conclusions: This  study
indicates that VEGF expression is associated with  angiogenesis, VEGF is one of the main
angiogenic factors for  OSCC.  Quantification of VEGF  and MVD in oral tissues may provide a
valuable marker for a prognosis of patients with  OSCCs.
[Keywords]  Oral squamous cell carcinoma;         Microvessel  density; 

Vascular endothelial growth factor;        Prognosis
   肿瘤不仅通过肿瘤血管从宿主获得营养，而且还通过肿瘤血管向宿主输出大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移[1]。肿瘤细胞能够合成多种血管活性物质，直接或间接地作用于血管内皮细胞，促进血管形成，其中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，也称血管渗透因子（vascular penneability factor, VPF） 被认为是作用最强，特异性最高的调控因子，在许多肿瘤组织中均有较高水平的表达，且与肿瘤的生长、分化、复发和生存明显相关[2、3]。病灶微血管密度（microvessel density,MVD）的变化可能是血管内皮生长因子变化的结果。我们采用免疫组化技术评价MVD和VEGF在口腔鳞癌中的表达，并探讨二者与临床病理、预后的关系。
材 料 与 方 法

1．临床资料及切片制备 
    56例口腔鳞癌组织均取自泰安市中心医院口腔颌面外科1984年~1996年手术切除标本蜡块，患者年龄34～76（均56.8）岁，男34例，女22例，2001年12月31日为终访日期，最短随访5年或死亡。53例有完整的复查及随访资料，3例失访。颈部淋巴结转移与否以术后病理检查结果为准。所有病人术前均未接受化疗或放疗， 根据TNM国际统一分期法（UICC ）进行临床分期，Ⅰ期7例，Ⅱ 期16例， Ⅲ期20例，Ⅳ期13例。 组织学分级为1级18例，2级28例，3级10例。其中舌癌19例，颊癌15例，牙龈癌13例，口底癌4例，硬腭癌5例。蜡块制备5μm厚连续切片，分别用抗VEGF单克隆抗体和Ⅷ因子相关抗原抗体进行免疫组织化学染色，并做常规HE染色。
2．免疫组织化学染色
    鼠抗人VEGF抗体 由Santa Cruz公司提供，鼠抗人Ⅷ因子相关抗原抗体及SABC试剂盒为武汉博士德生物制品公司提供，3,3-二氨基苯联胺（DAB）为Sigma公司产品，染色方法参照试剂盒说明进行。分别用1.5%正常兔血清和0.01mol/L PBS液取代第一抗体作为替代对照和空白对照。
3.VEGF的判断标准
    肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，按照Volm等[4]的评判标准，选染色均匀的癌间质区，在400倍视野下，以着色细胞占视野细胞总数的多少分级0级~3级。0级：0；1级：<25%；2级：26%~50%；3级：>50%。0级为阴性，1级以上为阳性。
4.微血管计数判断标准
    按照Weidner等[5]评判标准，计算肿瘤着色的毛细血管和微小血管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者作为一个血管计数，计数方法为每张染色切片选择3个血管最多的癌间质区，在200倍视野下进行血管计数，每例标本分别计数5个视野，取其平均值。
5．统计学处理
    应用SPSS软件进行数据处理，用卡方检验判断VEGF表达、MVD计数与各临床病理因素、临床分期间的关系及5年生存率差异，VEGF与MVD关系采用t检验、生存曲线应用Kaplan-Meier法计算并作时序检验。P<0.05具有统计学意义。

实 验 结 果
1．VEGF的表达
    56例口腔鳞癌组织中，有29例VEGF染色呈阳性，阳性率为51.8%。VEGF主要表达于癌细胞浆或细胞膜， 强阳性染色的瘤细胞多位于浸润前缘。 在癌组织中，VEGF阳性物质主要位于癌细胞的胞膜或胞浆，而且肿瘤组织的周边细胞染色要强于中心组织。变性坏死癌组织周边VEGF染色较强。
2.MVD： 在口腔鳞癌中每三个高倍镜（×200）视野平均微血管计数为34.7±7.6（19～51）以MVD平均值分为高（35～51）、低（19～34）两组进行分析。染色的微血管通常位于癌巢间的基质，而在肿瘤侵袭的边缘最突出。
 
    分化程度不同的肿瘤中，其MVD及VEGF表达有着明显差别， 分化程度越低肿瘤中MVD及VEGF表达越高；发生淋巴结转移病人的MVD及VEGF表达阳性率均高于无转移者。但是未显示与肿瘤的大小有关。
    晚期口腔鳞癌的MVD显著高于早期病例，Ⅲ、Ⅳ期组高于Ⅰ、Ⅱ期组（P<0.05），但未见VEGF表达与临床分期明显相关（P>0.05）。

   53例接受根治性手术的病人5年总体生存率为58.5%(31/53)， VEGF表达阳性口腔鳞癌病人5年生存率42.9%(12/28)，表达阴性者76.0%(19/25) ，经X2检验VEGF阳性者病人5年生存率较阴性者有明显差异（p<0.05）。MVD计数高口腔鳞癌病人5年生存率36.8%(7/19)，低者为70.6%（24/34），经X2检验MVD计数高口腔鳞癌病人5年生存率较低者差（p<0.05）。56例病人术后Kaplan-Meier生存率曲线经时序检验有显著差异（p<0.05）。
    　
　  MVD记数高、低者生存率比较    

　  VEGF阳性、阴性者生存率比较
4．VEGF表达和口腔鳞癌组织微血管密度的关系
    肿瘤组织内的血管被染成棕褐色，清晰可见。癌组织变性坏死区内血管稀疏。VEGF表达阳性口腔鳞癌组织的血管计数（x=39.4，n=29，s=4.1）显著高于VEGF表达阴性口腔鳞癌的血管计数（x=29.3，n=27，s=4.2）而且随VEGF表达强度的增强，癌组织内血管密度明显增加（p<0.05）。

 讨      论

    血管形成（angiogenesis）与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关，许多文献报道微血管密度和血管内皮生长因子在肿瘤中具有重要的预后意义[6、7、8]。VEGF是目前已知的促血管形成的主要细胞因子。它是二硫键连接的糖蛋白二聚体，有同一N端而其它区域有差异的两条多肽链组成。人体细胞分泌4种VEGF多肽，分别有165、189、206、121个氨基酸残基组成[9]。
    VEGF广泛的表达于成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等多种细胞，但VEGF的受体（flt-1、flk-1）则仅表达于血管内皮细胞，因此它是一个特异作用于血管内皮细胞的因子。本研究结果证实，口腔鳞癌细胞也能分泌VEGF，其阳性表达率为51.8%。VEGF主要表达于癌细胞浆或细胞膜，正常的口腔组织未见VEGF表达的阳性染色，弱VEGF阳性染色见于某些血管内皮细胞。提示口腔鳞癌是以癌细胞为主表达VEGF的。从VEGF在口腔鳞癌组织中的表达分布看，VEGF的阳性表达在肿瘤组织边缘部分强度高于其中心部位，表明肿瘤边缘部分的瘤细胞生长旺盛，有更强的诱导新生血管形成的能力，于癌浸润前缘，微血管密度也较高，新生血管化程度活跃，显示了VEGF表达与新生血管化部位的一致性及其与浸润性生长的关系，这与恶性肿瘤的生长特性十分吻合。本研究发现,在口腔鳞癌组织中，VEGF的阳性率达51.8％，低分化组高达70%，其表达与肿瘤病理分级有关，但与肿瘤的临床分期无关，VEGF在早晚期口腔鳞癌的表达率无差异。这提示，在肿瘤发生、发展的整个过程都可能有VEGF的分泌。本文对VEGF表达与颈淋巴结转移的关系进行分析，结果证明，VEGF阳性病例者颈淋巴结转移的机会大于 VEGF阴性者，VEGF 表达与颈淋巴结转移呈正相关关系。VEGF使血管的形成增加，出现大量结构和功能异常的肿瘤血管，这类新生血管管壁不完整，缺乏基膜，同时VEGF是已知最强的血管渗透剂，能增加微血管特别是毛细血管后静脉和小静脉的渗透性。癌灶区的血管通透性增加，但又缺乏有效的淋巴循环，造成大量的瘤内及瘤周间质水肿，这不仅使组织间隙变宽和开放，而且大量组织间液在回流过程中引导瘤细胞沿着组织间隙向毛细淋巴管方向运动，最后随组织液一起进入到毛细淋巴管，最终导致淋巴道转移。
    本组资料显示，VEGF阳性口腔鳞癌病人的预后明显较VEGF阴性者差。原因可能为口腔鳞癌组织分泌VEGF诱导血管形成，并增加血管的通透性，促进肿瘤的生长和转移，从而影响生存率。 由Kaplan-Meier生存率曲线可以看到，VEGF阳性表达与口腔鳞癌患者的预后关系密切，VEGF阳性者的5年生存率明显低于VEGF阴性者。因而，VEGF表达程度反映口腔鳞癌的生物学特性，是一个有意义的预后指标。有可能将VEGF表达状态和其他预后因子结合起来，以判断有较高恶性和转移危险的病例，并对手术后选择辅助治疗提供指导。

  MVD被认为是反映肿瘤血管生成的一个代表性指标，它不仅与肿瘤细胞的营养和供氧有关，而且也反映了肿癌的浸润和转移能力。我们的研究也证实了此点。恶性肿瘤区别于良性肿瘤最重要的生物学特征就是浸润和转移。目前认为[10]实体肿瘤细胞的生长期可分为血管形成前期和血管化的浸润生长期。在形成实体瘤的血管前期，其原发肿瘤直径最多不超过1～3mm，而一旦触发新生血管形成的机制，肿瘤将呈现不可控制的生长势态，甚至在2周内体积达到原先的16000-19000倍，因而有人甚至提出肿瘤具有血管依赖性。本研究发现不同大小的口腔鳞癌中MVD差异无显著性，即说明口腔鳞癌生长对血管的依赖性。Weidman等[11]对乳腺癌的研究发现 MVD每增加10个，淋巴结转移的危险度就增加1.59倍，远处转移的危险度增加1.17倍。本研究亦发现有淋巴结转移和无淋巴结转移的两组病例比较，MVD差异具有显著性。由于口腔鳞癌发生淋巴结转移的机会远高于血行转移，提示对原发灶的MVD检测有利于作出是否发生局部转移和预后优劣的判断。本研究显示高分化组的MVD 低于中低分化组，提示肿瘤细胞的分化程度越低，其诱导血管生成的能力越强，这与临床观察到分化程度低的肿瘤局部浸润和转移的发生率较高是吻合的。本研究表明TNM分期越晚期，MVD越高，在5年生存率比较中，MVD高组生存率明显低于MVD低组。 这也提示：不同分化程度肿瘤转移预后不同的原因与微血管密度有关。因此MVD可作为反映口腔鳞癌生物学行为、转移潜能及预后的指标。
    大多数学者认为VEGF的表达与MVD的大小有明显的相关性。我们的研究表明VEGF高表达者，其MVD值显著增加。二者间存在着明显的正相关性，说明在肿瘤血管形成中，VEGF有着较强的促血管形成作用，是重要的血管形成因子之一。
参考文献
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11  Weidman N.Intratnmor microvessel density as a  prognostic in cancer.Am J Pathol,1995,147:9